一、準(zhǔn)備工作（無(wú)菌是關(guān)鍵）

1. 環(huán)境與儀器

• 提前 30 分鐘開超凈臺(tái)紫外燈滅菌，用 75% 酒精擦拭臺(tái)面與儀器外殼。

• 連接主機(jī)與真空泵，檢查管路密封無(wú)泄漏；濾杯、底座 121℃濕熱滅菌 20 分鐘備用。

2. 耗材與試劑

• 備好無(wú)菌濾膜（0.45μm，直徑 50mm，有網(wǎng)格面便于計(jì)數(shù)）、無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌鑷子（酒精燈火焰滅菌）、廢液瓶（加消毒液）。

• 準(zhǔn)備稀釋液（無(wú)菌生理鹽水）、對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基（細(xì)菌用 TSA，霉菌 / 酵母用 SDA）、供試品稀釋液。

3. 樣品預(yù)處理

• 液體樣品：搖勻后按標(biāo)準(zhǔn)稀釋；固體樣品：無(wú)菌均質(zhì) / 浸提后取上清；含抑菌成分的樣品需預(yù)留沖洗步驟。

二、核心操作步驟（步步有標(biāo)準(zhǔn)）

1. 濾膜安裝（超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌操作）

• 無(wú)菌鑷子夾取濾膜，有網(wǎng)格面朝上，平整放在濾杯底座支撐篩板上，無(wú)褶皺、無(wú)氣泡。

• 扣上濾杯并旋緊 / 卡緊，確保密封不漏氣。

2. 樣品過(guò)濾（控制流速防破損）

• 無(wú)菌轉(zhuǎn)移規(guī)定體積的供試品溶液至濾杯，避免液面過(guò)高。

• 啟動(dòng)真空泵，打開閥門，控制負(fù)壓流速（一般 10–30mL/min），防止濾膜破裂或微生物截留不全。

• 樣品完全濾過(guò)（濾膜無(wú)明顯水珠）后，先關(guān)閥門再關(guān)泵。

3. 濾膜沖洗（可選，去抑菌殘留）

• 含防腐劑 / 抗生素的樣品，用無(wú)菌生理鹽水沖洗濾膜 3 次，每次 50–100mL，每次沖完再抽干。

4. 濾膜轉(zhuǎn)移與培養(yǎng)（貼平無(wú)氣泡）

• 無(wú)菌取出濾膜，菌面朝上平貼于培養(yǎng)基表面，輕壓排盡氣泡。

• 培養(yǎng)皿標(biāo)記樣品信息，倒置放入培養(yǎng)箱：細(xì)菌 30–35℃培養(yǎng) 3–5 天，霉菌 / 酵母 20–25℃培養(yǎng) 5–7 天。

5. 結(jié)果觀察與計(jì)數(shù)

• 培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)數(shù)濾膜上菌落數(shù)（CFU），按稀釋倍數(shù)換算樣品微生物限度；記錄菌落形態(tài)、顏色等特征。

三、收尾與維護(hù)（延長(zhǎng)儀器壽命）

1. 儀器清理

• 濾杯用中性洗滌劑浸泡后軟布擦洗，清水沖凈晾干；陽(yáng)性樣品過(guò)濾后需 121℃滅菌 20 分鐘再清洗。

• 管路用純化水沖凈，廢液按生物危害廢棄物處理。

2. 日常維護(hù)

• 定期檢查真空泵負(fù)壓與管路密封性；濾膜支撐網(wǎng)避免劃傷，及時(shí)更換老化密封圈。

四、小白避坑指南（關(guān)鍵注意點(diǎn)）

1. 濾膜安裝必須平整無(wú)褶皺，否則易漏液或菌落重疊，導(dǎo)致計(jì)數(shù)不準(zhǔn)。

2. 過(guò)濾流速不能過(guò)快，防止濾膜破裂或微生物被沖失。

3. 轉(zhuǎn)移濾膜時(shí)避免用鑷子劃傷膜面，菌面朝上是計(jì)數(shù)前提。

4. 全程無(wú)菌操作，減少環(huán)境微生物干擾，必要時(shí)做陰性對(duì)照（僅過(guò)濾稀釋液）。